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Agilent miRNA マイクロアレイ

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miRNA解析用のAgilent Technologies社のマイクロアレイです。プローブは60mer前後のオリゴヌクレオチドプローブで、成熟型(完成型)のmiRNAのみを検出することが可能です。miRNAプローブは SANGER miRBase (Release 10.1) の登録情報を基に設計されました。各miRNAにつき1〜4種類のプローブデザインが存在し、各プローブは10〜20の繰り返しスポットされております。Agilent miRNAマイクロアレイには次ぎのラインナップがございます。

miRNAマイクロアレイ 検出miRNAの由来
Genome Viruse
 ヒ ト  miRNA マイクロアレイ Version2 723 76
 マウス  miRNA マイクロアレイ 567 10
 ラット  miRNA マイクロアレイ 350
SANGER miRBase (Release 9.1)を基に設計された旧ヒトアレイと現行ヒトアレイ(Version2)にはデータ互換性がありません。

プローブのデザインは、Linker配列、標的のmiRNAに相補的な配列、ヘアピンキャップ構造の配列の3つから成ります。ヘアピンキャップ構造によりmiRNAの長さを選択することができ、前駆体であるPre-miRNA、Pri-miRNA は結合することができず、成熟型(完成型)のmiRNA のみがプローブに安定してハイブリダイゼーションできます。

詳細は、Agilent Technologies社の論文をご参照ください(http://www.rnajournal.org/cgi/content/short/rna.234507v1 )。

Agilent miRNA マイクロアレイ

図中の黒い部分は、合成された配列である未修飾のマイクロアレイプローブ(黒)で、この部分が、ターゲットとなるmiRNA(赤)とハイブリダイゼーションにより結合します。プローブはスティルト(オリゴヌクレオチドで構成された足)(茶)によりガラススライド表面に固定されています。
A : hybridization sequenceの5'末端にあるG残基(黒)は、miRNAの3'末端にラベリングにより導入されたC残基(黄)と相補的に結合します。このG-C対がプローブとターゲットの反応領域に加わることで、ターゲットとなるmiRNAが、他の相同なRNAよりもプローブに安定して結合します。また、すべてのプローブには、プローブとターゲットの反応領域に隣接して5'末端ヘアピン(青)が付加されており、miRNAのサイズに対する特異性を高めています。
B : 安定性が高すぎるため最適化が必要なプローブでは、miRNAの5'末端から塩基配列を除去することで、プローブとターゲットの安定性を調節しています。

開始total RNA量はわずか100 ngであり、miRNAまたはsmall RNAへ濃縮精製する必要がございません。miRNAを含むtotal RNAはCalf Intestine Alkaline Phosphatase (CIP) によって脱リン酸化反応を行います。続いて、T4 RNA Ligaseを用いてRNA分子の3’末端側に1分子のCyanine 3-Cytidine Bisphosphate (pCp-Cy3) を標識します。カラムによって精製を行った後、標識miRNAをAgilent miRNA microarrayにハイブリダイズさせます。ハイブリダイゼーション後に洗浄を行い、Scanner (Agilent Technologies社) でシグナルを検出し、Feature Extraction (Agilent Technologies社) で数値化を行います。

miRNAマイクロアレイ解析後、リアルタイムPCR解析(TaqMan(R)ケミストリー)をご希望の場合は、別途お問い合せください。



図はAgilent Technologies Inc.の許可を得て掲載しています。


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