BMRフィードバックシステム

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BMRではお客様にお渡しするデータの信頼性を高めるために、実験の各工程において成否を判定するためのチェックポイントを設けており、その判定を元に解析進行を決定しております。

BMRフィードバックシステム

RNA品質チェック

●	Bioanalyzerによる電気泳動パターンのチェックお客様からお預かりしましたTotal RNAは、Agilent社のBioanalyzerによる電気泳動を介した泳動パターンと、NanoDropによる吸光度測定に基いたRNA濃度・RNA量の測定を行っています。

これはBioanalyzerによるチェックの図です。品質的に問題無いサンプルは28Sと18Sの量比は2:1であること、DNA等のコンタミネーションが無いことが理想的であるといわれています。しかし場合によっては、RNAの分解、DNAなどのコンタミネーションによって泳動パターンに乱れが生じる場合があります。このようなサンプルの場合には、程度によりますが、そのまま次の段階に進むか、お客様にもう一度別のサンプルを御用意頂くか、解析を続行するかを確認させて頂きます。

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NanoDropによる吸光度測定

NanoDropによる吸光度測定では、濃度・絶対量の測定の他に、260/280の吸光度比率を算定し、品質の判定基準の1つとしております。解析に問題無いと判断される吸光度比率は1.8～2.1の範囲内に数値があることですが、例えば多糖類の存在比率が高い場合230nmでの吸光度が検出され、その影響で比率が2.1よりも高くなる場合があります。また、フェノール類、タンパク質の存在比率が高い場合、吸光度比率が1.8よりも下回る傾向にあります。これら濃度、絶対量、吸光度比率から総合的に判断して、それ以降の実験を行うか否かの判断を行い、場合によってはお客様に試料の再送付をお願いする場合がございます。

合成cRNAチェック

●	お客様のサンプルによる合成cRNAのチェック BMRでは、cRNA合成の段階においてもチェックポイントを設けております。弊社ではcRNA合成量の下限を30μgに設定しておりますが、合成量がそれに満たない場合もあります。いずれの場合でもcRNA合成の段階まで戻るか、サンプルRNA自体に問題がある可能性が考えられる場合にはtotal RNAを再調製して頂くこともあります。

●	コントロールRNAによる合成cRNAのチェック cRNA合成に用いた試薬や実験上の操作に問題があるか否かを判定する為に、コントロールRNAサンプルを用いて、お客様のサンプルと同時進行で作業を行います。もし、お客様のサンプルからのcRNA合成にトラブルが生じた場合、コントロールRNAでの合成に問題が無ければ、cRNA合成操作自体に問題は無く、お客様から頂いたサンプルに問題がある可能性がございます。もし、コントロールRNAからのcRNA合成自体に問題がある場合は、実験操作もしくは実験時に使用した試薬に問題があることになります。

●	Test3ArrayによるcRNAのチェック（GeneChip（R)アレイヒト・マウス・ラットのみ標準仕様）

Affymetrix社ではGeneChip（R)アレイでの解析を行う前段階のツールとして、合成されたcRNAの品質チェックを行うためのチップ、Test3Arrayが発売されております。BMRでは、このTest3Array解析を、GeneChip（R)にラインナップされているヒト・マウス・ラットに対して標準で行います。このTest3Arrayでは、解析対象生物固有の遺伝子やハウスキーピング遺伝子のmRNA配列の3’側、5’側にそれぞれプローブが設計されており、それぞれのシグナル強度から3’/5’シグナル比を算出します。mRNAの分解度が低く、夾雑物の少ないサンプルを用いて行うcRNA合成では、3'/5'シグナル比は１に近くなります。しかしながらmRNAの分解度が高かったり、cDNAもしくはcRNA合成を阻害するような夾雑物のあるサンプルを用いてcRNA合成を行った場合、5’のシグナルが低くなるため、3’/5’シグナル比は1より大きくなります。 cRNA合成の手法によって分解度の指標となる基準値が設定してあり、例えばOne-Cycle Target Labeling法で合成したcRNAのハウスキーピング遺伝子の3'/5'シグナル比は3.0が基準値になっています。BMRでは、この基準値を参考にして、合成したcRNAがハイブリダイゼーションに適しているかを判定しております。

生データチェック

●	Spike-inコントロール、Hybridizationコントロールによるチェック

Spike-inコントロール、Hybridizationコントロールによるチェック

Spike-in、Hybridizationコントロールによる確認

Affymetrix社ではcRNA合成段階において、Spike-in コントロールという、他生物種由来のRNA配列にpoly-Aを付加したコントロールRNAをお客様のサンプルに混合し、同時にcRNAを合成させるシステムを採用しています。このspike-in コントロールは濃度勾配をつけた複数種のRNAから構成されており、それぞれの濃度に応じたcRNA合成をモニタすることが可能です。また、ハイブリダイゼーションカクテルにはHybridization コントロールという、やはり濃度勾配を付けられた複数種の、他生物種由来の合成標識RNAを混合し同時にハイブリダイズするシステムになっています。
BMRでは、生データ取得後に必ずこれらのコントロールデータを確認しております。万が一、コントロールデータに問題があった場合、どの段階で問題が生じたかを直ぐに確認でき、その段階まで立ち返って（フィードバック）操作をやり直すことにより、信頼性の高いデータをお客様にお返ししております。

品質チェック

●	使用試薬の品質チェック BMRでは、お客様のサンプルを取り扱うための試薬の品質チェック、Lotチェックを厳密に行っております。 BMRに納品された試薬は全Lotに対し、弊社が用意したコントロールRNAサンプルを用いて、十分な品質のcRNAが合成されることを確認致します。この試薬品質チェックをクリアしない試薬に関しては使用致しません。

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