リアルタイム定量PCR受託解析

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＊弊社使用機器は、写真と異なりハンドラを使用しておりません。

BMRでは、Applied Biosystems Inc. (ABI) とリアルタイムPCRに関するライセンス契約を締結し、リアルタイム定量PCRの受託解析を行っております。ご提供するリアルタイム定量PCRは、TaqMan(R) Probe Chemistryを使用したTaqMan(R) Gene Expression Assays、または、Custom TaqMan(R) Genomic Assaysによる反応を行います。(MicroRNA Assays、SNP Genotyping Assays、SYBR(R) Green I Dye Chemistryなどにつきましては、お問い合せください。)
リアルタイム定量PCRの反応は、まずサンプル total RNA からランダムプライマーと逆転写酵素を用いて鋳型となるcDNAを合成します。開始RNA量は、解析を行う遺伝子数によって異なります。次に、合成されたcDNAと、TaqMan(R) Gene Expression Assays、TaqMan(R) Universal PCR Master Mixを混合し、Applied Biosystems 7900HTリアルタイムPCRシステムにて反応を行います。反応には、標的となる遺伝子のほかに、初期RNA量の補正を行うための内部標準遺伝子も必要になります。また、各遺伝子につき、定量を行うためのUnknownサンプルと、検量線作成用のStandardサンプルが必要です。定量方法は、検量線を用いた相対定量方法を使用します。(絶対定量法につきましては、お問い合せください。)

リアルタイム定量PCR後のデータは、SDS 2.2 ソフトウェアを使用し、作成された検量線からUnknownサンプルの定量を行い、対象遺伝子のサンプル間の遺伝子発現変化を算出いたします。

SDS 2.2 解析例

リアルタイム定量PCR

リアルタイムPCRの定量は、一定のPCRの増幅量に達した際のサイクル数を、濃度既知のサンプルと濃度未知の定量用サンプルのそれぞれから求め、濃度既知のサンプルから作成した検量線をもとに、濃度未知のサンプルを定量するという原理を用います。リアルタイムPCRの反応終了後に、PCR反応のサイクル数に対して、増幅されたPCR産物に相当する蛍光シグナル(ΔRn)をプロットしたAmplification Plot (増殖曲線)を作成します。次に、指数関数的に増幅されている領域にベースラインを引き(Threshold Line)、各増殖曲線上でこのThresholdの値に相当するサイクル数をThreshold Cycle (Ct) 値と定義します。濃度既知のサンプルの、濃度とCt値から検量線を作成し、この検量線を用いて定量用サンプルのCt値から濃度を算出します。

TaqMan(R) Probe Chemistry

TaqMan(R) プローブは、両末端 (5’末端 = Reporter, 3’末端 = Quencher) を結合した20～30 merの長さのオリゴヌクレオチドで、相補的な配列を特異的に認識するように設計されています。PCR反応前のプローブの状態は、レポーターとクエンチャーの距離が近く、レポーター色素の蛍光はクエンチャーにより消光されます。
PCRによる伸長が起こると、DNAポリメラーゼによって、レポーター色素がTaqMan(R)プローブより分離されます。クエンチャーからレポーター色素が解離することで、蛍光を発することができ、この蛍光を検出することで、PCRによる増幅量を正確に捕捉することが可能です。

SYBR(R) Green I Dye Chemistry

SYBR(R) Green を用いた検出は、二本鎖DNAに特異的に結合して発光するSYBR(R) Green Iを使用します。プローブを必要とせずプライマーのみであるため、非特異的な反応が起こらないプライマーの設計が重要になります。

TaqMan(R) Gene Expression Assays

TaqMan(R) Gene Expression Assays は、Applera 社によって設計および合成されたプライマーとプローブが混合された試薬です。現在、ヒト、マウス、ラット、シロイヌナズナ、ショウジョウバエの各生物種について、それぞれ数万種類以上の試薬が存在します。TaqMan(R) Gene Expression Assaysは、TaqManケミストリを利用しているために、遺伝子の Exon を特異的かつ正確に検出することが可能です。

Assaysには以下の2種類があります。
「Inventory Assays」 -------　合成済、ABIにて通常在庫
「Made to Order Assays」----　受注後に合成開始

内部標準

リアルタイムPCR反応後に解析を行う上で、サンプル間の初期RNA量を補正するために内在性コントロールの定量値が必要になります。内在性コントロールとして使用する遺伝子には、GAPDHやβ-Actinといったハウスキーピング遺伝子や、18S rRNAなどが考えられます。ハウスキーピング遺伝子は、一般的に発現量が一定であると思われる傾向がありますが、細胞種、組織間、発生の各段階などで発現量が大きく異なる遺伝子があり、これらの遺伝子を内部標準として用いることで補正されるデータに大きなバイアスが生じる可能性があります。内在性コントロールには、解析を行うサンプル間で発現量に大きな変化がない遺伝子を選択してください。
ヒトのサンプルを使用する場合には、内在性コントロールとなり得る遺伝子を検討するための、11種類の遺伝子用TaqManプローブがセットになったTaqMan(R) Human Endogenous Control Plateがあります。BMRではオプションにて、このTaqMan(R) Human Endogenous Control Plateを使用した内在性コントロール遺伝子の評価を行います。

定量方法

定量方法は、検量線を用いた定量法と、検量線を用いない相対定量法があります。検量線を用いた定量法は、実験時のPCR反応効率を反映した検量線を用いて定量するために結果の精度が高くなります。さらに、検量線を使用する絶対定量法と相対定量法の2種類に分けられ、絶対定量は、分子量が明確で分子量を算出することができるベクターに組み込んだ核酸分子などを人為的に作製して、検量線から絶対量を算出する方法です。検量線を用いた相対定量は、解析目的のcDNAサンプルを標準サンプルとして使用し、連続希釈系列を作製して相対的定量値を算出する方法です。
検量線を作成しない相対定量(比較Ct法)は、PCR反応効率が一定であることを前提とした相対的定量方法ですが、基準としたサンプルとの濃度差が大きくなるほど誤差も大きくなります。

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